分子生物學(xué)是在生物化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，以研究核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等生命本質(zhì)的學(xué)科，在核酸、蛋白質(zhì)分子水平研究發(fā)病、診斷、治療和預(yù)后的機(jī)制。其中基因工程（基因技術(shù)，基因重組）是目前分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)，這些技術(shù)可以改造或擴(kuò)增基因和基因產(chǎn)物，使微量的研究對象達(dá)到分析水平，是研究基因調(diào)控和表達(dá)的方法，也是分子水平研究疾病發(fā)生機(jī)制、基因診斷和基因治療的方法。轉(zhuǎn)化（transformation）、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)位等是自然界基因重組存在的方式，也是人工基因重組常采用的手段�；�因重組的目的是基因克�。�gene clone），基因克隆可理解為以一分子基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增得到的與模板分子結(jié)構(gòu)完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混雜的目的基因易于純化，得以增量，便于分析。

　　外來基因引起細(xì)胞生物性狀改變的過程叫轉(zhuǎn)化（transformation），以噬菌體把外源基因?qū)�入�?xì)菌的過程叫轉(zhuǎn)染（transfection）。利用載體（噬菌體或病毒）把遺傳物質(zhì)從一種宿主傳給另一種宿主的過程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。一個(gè)或一組基因從一處轉(zhuǎn)移到基因組另一處的過程叫轉(zhuǎn)位（transposition），這些游動的基因叫轉(zhuǎn)位子。

　　一、基因工程的常用工具

　　（一）載體

　　載體（Vector）是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增、表達(dá)的工具。載體有質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質(zhì)粒（粘粒）、病毒等。載體具有能自我復(fù)制；有可選擇的，便于篩選、鑒定的遺傳標(biāo)記；有供外源DNA插入的位點(diǎn)；本身體積小等特征。

　　質(zhì)粒存在于多種細(xì)菌，是染色體（核）以外的獨(dú)立遺傳因子，由雙鏈環(huán)狀DNA組成，幾乎完全裸露，很少有蛋白質(zhì)結(jié)合。質(zhì)粒有嚴(yán)緊型和松弛型之分。嚴(yán)緊型由DNA多聚酶Ⅲ復(fù)制，一個(gè)細(xì)胞可復(fù)制1-5個(gè)質(zhì)粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ復(fù)制，一個(gè)細(xì)胞可復(fù)制30-50個(gè)質(zhì)粒，如果用氯霉素可阻止蛋白質(zhì)合成，使質(zhì)粒有效利用原料，復(fù)制更多的質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)過改造品種繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。這些質(zhì)粒都含有多個(gè)基本基因，如復(fù)制起動區(qū)（復(fù)制原點(diǎn)Ori），便于復(fù)制擴(kuò)增；抗抗生素標(biāo)記（抗氨芐青霉素Ap^r、抗四環(huán)素Tc^r等）或大腸埃希菌部分乳糖操縱子（E.coli LacZ）等，便于基因重組體的篩選；基因發(fā)動子（乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等）和轉(zhuǎn)錄終止序列，便于插入的外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)。質(zhì)粒上還有許多限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，即基因插入位點(diǎn)，又叫基因重組位點(diǎn)，基因克隆位點(diǎn)。

　　常用噬菌體載體有單鏈?zhǔn)删�體M13系統(tǒng)；雙鏈?zhǔn)删�體系統(tǒng)。噬菌體應(yīng)和相應(yīng)的宿主細(xì)胞配合使用。以上載體各有特點(diǎn)，便于選擇，靈活應(yīng)用。

　�。ǘ�）工具酶

　　工具酶是基因重組技術(shù)不可缺少的工具。主要有限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶等。

　　限制性內(nèi)切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶之分，Ⅱ型能嚴(yán)格識別核酸序列，并在識別區(qū)內(nèi)特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶。識別分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉(zhuǎn)對稱。切口分開端和粘端，產(chǎn)生3′－OH和5′－P末端。內(nèi)切酶品種多，使用時(shí)應(yīng)注意溫度、緩沖液用量（一般1μg DNA/2-5單位酶）等反應(yīng)條件。

　　連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端，也連接粘端。反應(yīng)需有Mg²⁺和ATP存在，pH7.5-7.6。*適溫度37℃，30℃以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNa 的穩(wěn)定性和粘性末端的退火溫度，一般平端連接用20-25℃，粘端連接用12℃左右。

　　聚合酶有DNA聚合酶（以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA為模板合成DNA，除RNA病毒中發(fā)現(xiàn)外，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆轉(zhuǎn)錄活性）。

　　大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌酶作用產(chǎn)生的一個(gè)大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，無3′→5′外切酶活性�？捎糜谌笨诜�譯（Nick translation）法標(biāo)記核酸，也可用于DNA序列測定，修補(bǔ)DNA鏈等。

　　核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應(yīng)的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)。

　　末端轉(zhuǎn)移酶在Mg²⁺存在下，選擇3′－OH端單鏈DNA為引物加成核苷酸，在Co²⁺存在下，選擇3′－OH端雙鏈DNA為引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端標(biāo)記和核酸連接的互補(bǔ)多聚尾（連接器）。

　　堿性磷酸酶去除5′－P，可防止二分子DNA片段5′端P基團(tuán)自身空間障礙，影響DNA分子之間的連接，一般用堿性磷酸酶處理載體DNA除去5′端P基團(tuán)，在連接酶作用下目的基因的5′端P先與載體3′端OH連接，再通過復(fù)制修復(fù)另一條鏈，使二條鏈完全連接。該方法大大提高了連接效率（圖18-1）。

圖18-1　經(jīng)堿性磷酸酶處理后載體DNA與目的基因DNA的連接

　　二、目　的　基　因

　　常把需研究的基因稱為目的基因，需分析的基因稱靶基因，在基因克隆過程中有時(shí)兩者均稱為插入基因，有時(shí)三者含義相近。簡單的原核生物目的基因可從細(xì)胞核中直接分離得到，但人類的基因分布在23對染色體上，較難從直接法得到。簡短的目的基因可在了解一級結(jié)構(gòu)或通過了解多肽鏈一級結(jié)構(gòu)氨基酸編碼的核苷酸序列基礎(chǔ)上人工合成。但多數(shù)的目的基因由mRNA合成cDNA（complementary DNA，反轉(zhuǎn)錄DNA）得到。CDNA通過各種方式與載體連接，克隆可得到全長cDNA或片段，用于探針制備、序列分析、基因表達(dá)等研究。因此以cDNA為研究材料反映了mRNA的轉(zhuǎn)錄及對以后翻譯的影響情況，即反映某一基因（DNA）外顯子的情況。（圖18-2）

圖18-2　目的基因cDNA的合成

　　三、基因庫的建立

　　建立基因庫的目的是為了便于目的基因的保存、擴(kuò)增和純化�；�因庫是利用工具酶，通過基因重組技術(shù)和轉(zhuǎn)化、篩選而建立，也是基因克隆的過程。實(shí)際上是利用低等生物如細(xì)菌、病毒、噬菌體等生長快，繁殖力強(qiáng)的特點(diǎn)，而作為一種核酸擴(kuò)增篩選的載體，把人類等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重組于其中，經(jīng)篩選，克隆得到目的基因與載體重組的重組基因，成為便于保存，取用方便的基因庫�；�因庫交流是研究室之間交流目的基因的常用方式。

　　（一）基因重組

　　基因重組方案很多，簡單的可用同一種限制性內(nèi)切酶分別在載體和目的基因切出相對應(yīng)的切口，便于連接。也可用末端連接酶合成連接器（圖18-3）。近年，Okayama方案為實(shí)驗(yàn)室普遍采用，該方法可得到全長的cDNA。

　�。ǘ�）轉(zhuǎn)化

　　轉(zhuǎn)化目的是把有復(fù)制能力，但在細(xì)胞外無復(fù)制活性的目的基因-載體重組體裝入細(xì)胞（大腸埃希菌），使目的基因隨載體在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)步驟介紹如下：

圖18-3　基因重組方案

　�、贝竽c埃希菌的處理（增加細(xì)胞膜通透性，便于基因進(jìn)入細(xì)胞）大腸埃希菌（E.Coli cells）接種于Lb agar培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)一晚。挑選3~5個(gè)大菌落，接種于50ml LB培養(yǎng)基，37℃，振搖培養(yǎng)一晚后，在A₅₅₀測定，要求細(xì)菌繁殖一定量（一般為細(xì)菌對數(shù)生長期），野生型（rec＋，5x10⁷cells/ml）為0.2-0.3，缺陷型（rec-，5x10⁷cells/ml）為0.5-0.6。離心棄去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl₂懸浮菌體。冰浴20分鐘，低溫離心。棄上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl₂懸浮。4℃可保存48小時(shí)，用于轉(zhuǎn)化，稱competent cells。

　　⒉質(zhì)粒（如經(jīng)基因重組建立的重組質(zhì)粒，基因庫等）的轉(zhuǎn)化 將competent cells（以美國BRL公司DH10B菌株為例）置冰水浴。同時(shí)將Falcon2059（傳熱系數(shù)穩(wěn)定）塑料試管置冰水浴。取100μl菌液（DH10B）于2059試管中，加10倍稀釋的巰基乙醇1μl，冰浴輕搖2分鐘，放置10分鐘。取0.1-50ng質(zhì)粒加入試管，輕輕搖勻，冰浴30分鐘。此間備好42℃水浴。并將SOC培養(yǎng)基置42℃備用。將試管置于42℃，輕搖45秒鐘，馬上置冰浴2分鐘。使competent cells熱脹冷縮，把質(zhì)粒導(dǎo)入菌體。加42℃SOC培養(yǎng)基0.9ml于試管，37℃培養(yǎng)1小時(shí)。1000rpm離心10分鐘，棄上清液，用200μlSOC培養(yǎng)基懸浮菌體。接種于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)一晚。已轉(zhuǎn)化的菌體可形成菌落（因質(zhì)粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其產(chǎn)物的基礎(chǔ)上對菌落進(jìn)行鑒定。并在LB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)。基因庫的建立、轉(zhuǎn)化、篩選、擴(kuò)增、純化的過程就是基因克隆的過程。

　　LB培養(yǎng)基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g NaCl，高壓滅菌，pH7.5。

　　SOB培養(yǎng)基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5g NaCl，高壓滅菌。另外準(zhǔn)備2mol/L鎂溶液（1mol/L氯化鎂與1mol/L硫酸鎂等量混勻，過濾滅菌），臨用前加1ml于100ml培養(yǎng)基。

　　SOC培養(yǎng)基（100ml）：臨用前加入1ml過濾滅菌的2mol/L葡萄糖。

　　四、核酸的分離與純化

　　核酸存在于多種細(xì)胞，如病毒、細(xì)菌、寄生蟲、動植物細(xì)胞；多種標(biāo)本中，如血液、組織、唾液、尿液等其它來源的標(biāo)本。因此分離方法復(fù)雜而多樣。又因各種DNA、RNA的豐度差異，各種分析方法對核酸的純度與量的要求有差異，因此在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對采用的方法有所了解和選擇。總的說來核酸的分離與純化是在溶解細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用苯酚等有機(jī)溶劑抽提（核酸溶于緩沖液，即水相），分離，純化；乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑沉淀，收獲。溶解細(xì)胞的方法因標(biāo)本不同而不同，有用SDS加NaOH，有用蛋白酶，有的用超聲波破碎等方法，苯酚提取主要使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機(jī)相，而核酸保留在水相，達(dá)到分離核酸的目的。實(shí)驗(yàn)上生物標(biāo)本中含量*多的就是蛋白質(zhì)。為了除去分離過程中殘留的有機(jī)溶劑，常用的方法是加冷乙醇和鹽沉淀核酸，通過離心回收核酸，然后用70％-80％乙醇洗滌沉淀，除去多余的鹽，以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促反應(yīng)。為了得到純的核酸可用蛋白酶除去蛋白，用RNA酶除去RNA，得到純的DNA，用DNA酶除去DNA而獲得RNA。目前開發(fā)了許多商品化的核酸分離柱，可簡單、快速地分離得到純度很高的DNA或RNA。其分離原理有的利用核酸的分子量差異，有的利用需分離核酸的特點(diǎn)與其特異性結(jié)合達(dá)到分離、回收的目的。

　�。ㄒ唬┵|(zhì)粒的分離與純化

　　含質(zhì)粒的E. Coli cells經(jīng)LB培養(yǎng)液250ml擴(kuò)大培養(yǎng)，倒入50ml離心管，4℃，3000rpm，離心15分鐘。棄去上清液。（棄去液丟棄前應(yīng)作消毒處理，以免污染環(huán)境）。加lysis buffer（50mmol/L Glucose，10mmol/l EDTA，25mmol/l Tris-HCl，pH8.0）1-2ml使之懸浮。放置室溫5分鐘，加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液（1mol/l NaOH 8ml，20％SDs 2ml，蒸餾水30ml）上下?lián)u勻，置冰水浴5分鐘。禁用混勻器，以免DNA分子斷裂），加2.5mol/L醋酸鉀緩沖液（pH4.8）2.6-5.2ml，上下?lián)u勻，冰浴5分鐘。4℃，3000rpm，離心15分鐘。沉淀蛋白質(zhì)。取上清液，加無水乙醇12-24ml（上清液的二倍）放室溫15分鐘后，10000rpm離心，棄上清液。加約為沉淀物體積的0.4倍TE（10mmol/l Tris-Hcl pH8.0，10mmol/l EDTA）溶解沉淀后，加0.2倍的7.5mol/L醋酸銨�？捎没靹蚱骰靹�，置冰浴10分鐘。4℃，10000rpm離心5min，棄上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/l Tris-HCl pH7.5，10mmol/l EDTA緩沖液，1/10體積的5mg/ml RNase，37℃，30分鐘保溫。加等量的phenol（酚）/CIAA（480ml氯仿，20ml異戊醇），混勻。4℃，10000rpm，離心5分鐘。取上層液加酚/CIAA重復(fù)一次。取上層液加1/10體積5mol/l NaCl和2倍無水乙醇，―20℃過夜或―70℃2小時(shí)以上。4℃，10000rpm，離心10分鐘，棄上清液。加80％乙醇不搖動，直接10000rpm離心，棄上清液，真空干燥。加適量（約200μl）TE溶解。測定含量后備用。

　�。ǘ�）重組質(zhì)粒中目的基因的分離與純化

　　先取少量純化的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶切出目的基因，經(jīng)電泳分離，確認(rèn)。以200μl含2mg DNA（重組質(zhì)粒）為例：取10μl含100μg DNA，加90μl TE。按1μg DNA加2-5U限制性內(nèi)切酶，1/10體積緩沖液，1-2小時(shí)保溫。緩沖液種類和酶反應(yīng)溫度因內(nèi)切酶種類而異。1/10體積3mol/l NaAc，2倍無水乙醇，－70℃，2小時(shí)（－20℃過夜），10000rpm，10分鐘離心，棄上清液（乙醇沉淀）。適量TE溶解沉淀（切斷的DNA質(zhì)粒與目的基因混合物），電泳分離（用相應(yīng)分子量DNA標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)電泳），在紫外光下觀察結(jié)果，與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量比較，確認(rèn)目的基因和內(nèi)切酶的切割效果。

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