一個準(zhǔn)確的ELISA檢測實(shí)驗(yàn)，必須包含三大要素：性能可靠的試劑盒、造模成功并準(zhǔn)確采集的樣本、可控環(huán)境且嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)操作，三者缺一不可。在操作過程中，經(jīng)常遇到樣本稀釋問題，需要進(jìn)行樣本稀釋。

一、在ELISA實(shí)驗(yàn)過程中，超過試劑盒檢測范圍的，樣本值高的可能情況     

1、樣本中待測物含量過高。一些高豐度蛋白來說，比如免疫球蛋白、脂聯(lián)素、C肽、載脂蛋白等，在樣本中本身含量就很高，有的達(dá)到mg/mL濃度。

2、一些受誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞上清中，大量表達(dá)，比如小鼠細(xì)胞誘導(dǎo)后，大量表達(dá)腫瘤壞死因子α（TNFα），小鼠胰島細(xì)胞受誘導(dǎo)后，大量表達(dá)胰島素（INS）。

3、在一些感染性疾病中，大量表達(dá)，比如乙肝表面抗原、C反應(yīng)蛋白。

4、疫苗原性研究時，注射疫苗的小鼠，會產(chǎn)生大量針對疫苗的抗體。

5、一些被濃縮的樣品，比如重組蛋白的產(chǎn)物，單克隆抗體純品等。

二.在ELISA檢測過程中，經(jīng)常會遇到這樣的問題：樣本測定OD值超過標(biāo)曲點(diǎn)OD值，造成測定數(shù)據(jù)無法直接使用。樣本必須進(jìn)行稀釋，如何確定測定樣本的稀釋倍數(shù)？ 樣本稀釋容易犯的錯誤有哪些？ 

1、稀釋不足。稀釋倍數(shù)不足時，容易導(dǎo)致*終結(jié)果偏小。

2、過度稀釋。過度稀釋時，容易導(dǎo)致*終結(jié)果偏大。

3、稀釋不夠規(guī)范，引入很多人為偏差。稀釋不夠規(guī)范，特別是大比例稀釋時，人為偏差大大增加。

三、如何確定測定樣本的稀釋倍數(shù)呢？樣本稀釋的原則如下：在查詢背景知識，或者通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了樣本濃度過高，需要進(jìn)行稀釋，就要根據(jù)以下原則，嚴(yán)謹(jǐn)操作和計(jì)算。

1、稀釋倍數(shù)合理。稀釋后樣本測定的OD值，要求落在標(biāo)準(zhǔn)品值OD值的半量程內(nèi)，假定標(biāo)準(zhǔn)品值的OD值是2.4，那么稀釋后的樣本，OD值接近1.2，在這個范圍附近，計(jì)算的濃度值*為準(zhǔn)確，以這個結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，得到的樣本濃度*準(zhǔn)確。

2、稀釋過程規(guī)范。特別是大倍比的稀釋，是梯度稀釋。比如樣本要稀釋200倍，就先稀釋10倍，再在10倍稀釋的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行稀釋20倍，得到200倍。

3、樣本取樣量不要太小。在樣本充足的情況下，樣本取樣量不要低于5uL，越低的取樣量，在混勻取樣過程中，誤差越大。

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